黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

油菜转抗草甘膦、抗虫基因获得双抗植株

以草甘膦为筛选剂,用农杆菌介导法将编码5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的aroA—M12基因和编码苏云金杆菌毒蛋白的Btslm基因导入到甘蓝型油菜优良品种湘油15号中。在用草甘膦对转化体进行筛选的基础上．对转基因再生植株进行了PCR检测、Southern blot和Western blot分析．结果证明外源基因确已导入到该油菜品种中,而且表达了相应的蛋白。对转基因植株进行抗草甘膦、抗虫性鉴定的结果表明．转基因植株具有抗草甘膦、抗虫的双重特性。研究结果还表明抗草甘膦的aroA—M12基因在植物基因转化中,既可以用作抗除草剂基因,又可以代替常用的抗生素标记,用作植物筛选标记基因。     

基因工程在环境保护中的应用

20世纪70年代伯格(P．Berg)利用内切酶把分属2个不同作用的DNA重组到一起,宣告了基因工程的诞生。基因工程是在分子水平上,用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质,在体外切割、拼接和重组、然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞．使外源DNA在受体细胞中进行复制和表达。按人们的     

高羊茅MAPK基因的克隆与表达分析

丝裂原活化蛋白激酶(M APK)是生物体内信号转导的重要组分,与生长、发育和逆境胁迫反应密切相关.为了研究草坪草对非生物逆境胁迫反应的分子机理,利用同源基因克隆法从4℃低温诱导的草坪草高羊茅(F estu-ca arund inacea Schreb.)幼苗cDNA文库中分离得到一个M APK的cDNA即F aMAPK 1,F aMAPK 1编码369个氨基酸残基的蛋白激酶,该蛋白激酶具有TEY的磷酸化基序.据推测的氨基酸序列的BLA ST同源性分析表明,F aM APK 1蛋白与水稻O sM APK 4蛋白的一致性为91.1%.N orthern杂交检测F aMAPK 1基因对逆境胁迫反应的结果表明冷(4℃)处理对根中F aMAPK 1基因的表达没有明显影响,但诱导叶中F aMAPK 1上调表达.而且低温(4℃)、高盐(250 mm o l/L N aC l)、干旱和100μm o l/L ABA都诱导叶中F aMAPK 1上调表达,表明F aM APK 1蛋白可能在高羊茅对非生物逆境胁迫的反应中起重要作用.     

Gassericin T基因的合成及其组成型表达载体的构建

目的:构建Gassericin T基因毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型表达载体。方法:根据乳酸菌素Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA编码的氨基酸的密码子转换成P.pastoris偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,获得了250bp左右的gat A片段(简称gat基因)。应用PCR方法从P.pastoris染色体中扩增了GAP启动子,大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的pAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将合成的gat基因克隆到pGAP9K质粒的多克隆位点中。结果:获得的gat及gap基因与预期结果一致,序列无碱基突变,构建的表达载体pGAP9K-gat经PCR、酶切鉴定完全正确。结论:成功构建了Gassericin T基因P.pastoris组成型表达载体,为下一步高效表达Gassericin T蛋白,进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。     

水生生物对重金属吸收和积累研究进展

综述了国内外在水生生物对重金属吸收和积累研究方面的最新进展。着重阐述了重金属毒性影响因素和鱼类对重金属吸收和积累机理方面的研究现状和趋势。     

利用人U6 snRNA启动子构建RNA干扰质粒载体

RNA干扰技术已经成为基因功能研究等领域的有力工具,构建带有筛选标记的siRNA载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达.为了利用RNAi技术开展生物学研究,在克隆载体pUC19的基础上改造构建了人类细胞小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）表达质粒pUC19NU.该质粒具有新霉素抗性标记和真核细胞复制起点,利用连入的人U6 snRNA启动子起始siRNA的转录.以EGFP 和p53为靶基因的干扰实验证明,所构建的siRNA表达质粒可以显著抑制细胞外源性增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）及细胞内源性p53蛋白的表达,而且抑制效果具有特异性.     

单眼睑缝合1周建立形觉剥夺性弱视猫模型

目的比较正常组、模型组及对照组的图形视觉诱发电位(PVEP)和扫描视觉诱发电位(SVEP)视力,研究各组的视觉电生理表现,探讨单眼睑缝合1周是否可以建立形觉剥夺性弱视模型。方法分析三组PVEP的波形变化、潜时及完成一次诱发反应的时间;比较各组由SVEP得出的客观视力。结果①正常组PVEP由2个波峰组成“M型”(正向波向上),模型组及对照组出现波的分离—波形由多个波组成,而且完成一次反应的时间延长。②缝合侧的N75延迟,SVEP视力较正常组差且差别有统计学意义。③对照组未缝合侧视力恢复到正常水平而缝合侧视力仍差且与正常组有统计学差异。结论短期形觉剥夺的视觉电生理变化是弱视猫的一种表现,单眼睑缝合1周即可建立形觉剥夺性弱视猫的模型。     

白头鹤孵卵后期的行为节律观察

作者于2003~2004年连续2年的4月末至5月初在黑龙江大沾河湿地自然保护区,对3对野生白头鹤(Grus monacha)的孵卵过程进行了定点观察,结果表明,白头鹤的卧巢行为(t=-4.92,P=0.00)和护巢行为(t=3.09,P=0.007)在雌、雄个体间存在极显著差异;不同孵卵阶段的卧巢行为(t=2.95,P<0.01)、护巢行为(t=4.29,P<0.01)和育雏行为(t=-6.79,P<0.01)表现出不同的节律性。天气状况是影响白头鹤孵卵期各行为的重要因素,晴天时的凉卵行为(t=1.55,P<0.01)和育雏行为(t=4.06,P>0.01)时间明显多于阴雨天。对雌、雄个体行为同时进行观察的结果表明,雌(雄)鹤卧巢行为的时间与雄(雌)鹤护巢行为的时间呈显著正相关(相关系数分别为R=0.94和R=0.86)。     

基于宏基因组学的猪群样本病毒探测方法的建立

极其多样的病毒广泛存在于我们周围的环境和动物体内,其中很多病毒是人类所未知的,而发现未知病毒常常受制于病毒常规检测技术的局限性.[目的]构建未知病毒检测技术平台.[方法]应用病毒宏基因组学的理念,结合新型分子诊断技术,首先利用过滤和核酸酶处理去除样品宿主核酸干扰,然后随机PCR扩增潜在的病毒宏基因组,最后通过大规模测序及序列分析获取病毒核酸信息.[结果]利用此技术我们对猪瘟病毒(CSFV)细胞培养物和猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪病料进行了分析,分别检测到序列总长度1680 bp,占基因组13.7％的CSFV序列和序列总长度834 bp,占基因组47.2％的PCV2序列;利用此检测技术平台研究一未知病原细胞培养物,通过测序和序列分析,结果显示56条序列中有26条为副流感病毒5型(PIV5)同源序列,覆盖了其基因组全长的16.4％;此外,应用本研究建立的方法结合新一代高通量测序,我们在混合的7份病原未知的病猪组织样品中检测到了1.1％的病毒序列,包括CSFV、PCV2、猪细环病毒(TTSuV)、猪bocavirus (PBoV)和人腺病毒6型(Ad6)等的部分基因序列.[结论]本研究建立的基于病毒宏基因组学的未知病毒的检测方法突破了传统病毒研究方法的缺陷,对于猪群样本中病毒的检测具有较高的敏感性,有望为新发、突发感染性疾病的诊断和监测提供技术支持.